Endotoksyny – Niewidoczne zagrożenie ukryte w bakteriach i naszym otoczeniu

4566

Endotoksyny to nie tylko pozostałość po bakteriach – to realne zagrożenie, które może zadecydować o bezpieczeństwie leku. W ramach projektu Miesiąc Partnera Klastra poznaj rolę, jaką odgrywają zaawansowane analizy endotoksyn w Jagiellońskim Centrum Innowacji – od wykrywania śladowych ilości LPS po zapewnienie zgodności z wymogami Farmakopei i normami GMP.

Endotoksyny – zagrożenie biologiczne i środowiskowe

Endotoksyny to cząsteczki, które dla wielu brzmią jak termin z podręcznika medycyny lub toksykologii, ale ich wpływ na zdrowie i otaczający świat jest znacznie bardziej realny, niż mogłoby się wydawać. Występują powszechnie i mogą wywoływać poważne reakcje zapalne. Co więcej, mimo że są częścią naturalnego ekosystemu, to w pewnych warunkach stają się niebezpieczne.

Endotoksyny to składniki ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych, uwalniane nie tylko w wyniku ich rozpadu (lizy)1 ale także podczas wzrostu i podziałów drobnoustrojów. Ich główna część aktywna to lipopolisacharyd (LPS), składający się z trzech elementów: lipidu A, który odpowiada za toksyczność, rdzenia oligosacharydowego i łańcucha O-antygenowego2.

Kiedy bakterie Gram-ujemne giną – na przykład podczas infekcji lub w trakcie leczenia antybiotykami – ich ściana komórkowa rozpada się, uwalniając endotoksyny do otoczenia. Układ odpornościowy szybko reaguje, aktywując tzw. szlak TLR4 (Toll-like receptor 4), który rozpoznaje LPS jako wroga. W odpowiedzi dochodzi do wydzielania cytokin prozapalnych, takich jak interleukina-1 (IL-1), interleukina-6 (IL-6) i czynnik martwicy nowotworów alfa (TNF-α). W małych ilościach reakcja ta pomaga zwalczyć infekcję ale problem pojawia się, gdy stężenie endotoksyn jest wysokie, ponieważ może to prowadzić do burzy cytokinowej, gorączki, wstrząsu septycznego, a nawet śmierci2,3.

Co ciekawe, coraz więcej badań wskazuje, że endotoksyny mogą brać udział nie tylko w ostrych infekcjach, ale też w rozwoju chorób przewlekłych, takich jak cukrzyca typu 2, miażdżyca, a nawet choroby neurodegeneracyjne4.

Endotoksemia metaboliczna i zagrożenia środowiskowe

Jednym z najlepiej udokumentowanych zjawisk jest tzw. endotoksemia metaboliczna – stan, w którym LPS przedostaje się z jelit do krwiobiegu5 i jest dziś uznawane za ważny czynnik rozwoju chorób cywilizacyjnych. W naszych jelitach żyją biliony bakterii6– wiele z nich to bakterie Gram-ujemne, a więc potencjalne źródło endotoksyn. W zdrowym układzie pokarmowym błona śluzowa jelit i komórki odpornościowe tworzą barierę ochronną, która nie dopuszcza endotoksyn do krwiobiegu. Problemy zaczynają się wtedy, gdy bariera jelitowa zostaje naruszona – np. przez stres, niezdrową dietę, alkohol czy infekcje. Wtedy LPS może przedostać się do organizmu, wywołując przewlekły stan zapalny7. Udowodniono, że dieta bogata w tłuszcze sprzyja temu procesowi5. Co więcej, już jedno wysokotłuszczowe danie może chwilowo zwiększyć poziom endotoksyn we krwi6.

Endotoksyny występują nie tylko w ludzkim organizmie, ale też w środowisku oraz mogą być uwalniane na wielu stanowiskach pracy. Ich źródła to m.in.:8,9

  • Powietrze w pomieszczeniach – endotoksyny obecne są w kurzu domowym, szczególnie tam, gdzie jest dużo materii organicznej (np. domy z dużą ilością tkanin, dywanów, zwierząt domowych)
  • Woda – instalacje wodne, zwłaszcza w szpitalach i zakładach przemysłowych, mogą być źródłem bakterii Gram-ujemnych, a co za tym idzie – endotoksyn
  • Przemysł rolniczy i spożywczy – pracownicy narażeni są na kontakt z endotoksynami w pyłach organicznych pochodzących ze zbóż, nawozów, kompostów
  • Hodowla zwierząt oraz laboratoria zwierzęce
  • Oczyszczalnie ścieków, składowiska odpadów
  • Pył glebowy, drzewny, alergeny roślin i grzybów

Znaczenie kontroli endotoksyn w farmacji – rola Jagiellońskiego Centrum Innowacji

Endotoksyny stanowią poważne zagrożenie dla bezpieczeństwa produktów leczniczych, zwłaszcza tych podawanych pozajelitowo – np. dożylnie lub podpajęczynówkowo oraz wyrobów medycznych. Mają właściwości pirogenne to znaczy, że po przedostaniu się do organizmu mogą wywołać u pacjenta silną reakcję zapalną oraz gorączkę. Nawet śladowe ilości LPSu (1ng/kg/h) mogą spowodować reakcję pirogenną. Źródłem zanieczyszczeń endotoksynami produktów farmaceutycznych i wyrobów medycznych mogą być surowce pochodzenia biologicznego (np. albuminy, enzymy), sprzęt i pojemniki niesterylne lub niedokładnie płukane wodą zawierającą LPS10.

Ze względu na stabilność endotoksyn (stosunkowo trudno ulegają degradacji termicznej oraz są odporne na zmiany pH)1 eliminacja ich z preparatów farmaceutycznych wymaga stosowania specjalnych technik, takich jak: ultrafiltracja, wygrzewanie w wysokiej temperaturze (np. 250°C przez 30 minut dla szkła laboratoryjnego) czy różnego typu metody chromatograficzne1,10.

Wszystkie produkty lecznicze i wyroby medyczne przeznaczone do kontaktu z krwią lub układem  nerwowym muszą być testowane pod kątem obecności endotoksyn. Do tego celu wykorzystuje się test LAL (Limulus Amebocyte Lysate), który opiera się na krwi skrzypłocza (Limulus polyphemus). Amebocyty tego stawonoga zawierają enzym, który aktywuje się w obecności LPS i powoduje koagulację11.

Wyróżniamy kilka wersji testu LAL12,13,14:

  • test żelowy (clot-based),
  • test chromogenny (z wykorzystaniem zmiany barwy),
  • test turbidymetryczny (zmętnienie jako wskaźnik stężenia LPS).

Graniczne poziomy dopuszczalnych endotoksyn zależą od rodzaju leku i drogi jego podania – np.:

  • dla roztworów dożylnych limit wynosi 5 EU/kg
  • dla preparatów podawanych podpajęczynowo – 0,2 EU/kg
  • dla wyrobów medycznych – 20EU/wyrób (farmakopea europejska, przewodnik USP)

W Laboratorium Analiz Biologicznych Jagiellońskiego Centrum Innowacji stosujemy metodę kinetyczno-chromogenną z wykorzystaniem urządzenia Endosafe Nextegen-PTS. Technologia pozwala na oznaczenie ilościowe poziomu endotoksyn nawet na poziomie 0,005 EU/ml a dodatkową zaletą jest krótki czas trwania analizy (około 20 minut). Poniżej przedstawiamy przykład badania poziomu endotoksyn w różnych próbkach wody, gdzie celem było sprawdzenie skuteczności metody jej oczyszczania na obniżenie poziomu endotoksyn. Woda jest istotnym rozpuszczalnikiem wielu leków podawanych drogą pozajelitową czy dożylną. Stąd bardzo ważne jest bezpieczeństwo jej stosowania poprzez zapewnienie jej czystości, w tym odpowiedniego poziomu endotoksyn. Farmakopea wskazuje na limit dla wody do wstrzykiwań <0,25 EU/ml.

Poniżej przykłady dla wody wodociągowej, wody ultraczystej (filtrowana z pomocą systemu Milipore) oraz wody do wstrzykiwań.

Woda wodociągowa: >0,5 EU/ml

Woda ultraczysta: <0,005 EU/ml

Woda do wstrzykiwań: <0,005 EU/ml

Endotoksyny są nieodłącznym elementem naszego otoczenia i mikrobiomu. Choć w kontrolowanych ilościach są neutralne, ich nadmiar prowadzi do poważnych problemów zdrowotnych – mogą zanieczyszczać leki i wyroby medyczne, stanowiąc realne ryzyko dla pacjentów. Nawet śladowe ilości mogą wywołać niepożądane reakcje, szczególnie w przypadku preparatów podawanych dożylnie czy podpajęczynówkowo. Z tego powodu każda partia takich produktów musi przejść rygorystyczne testy na obecność endotoksyn, zgodnie z wymaganiami Farmakopei Europejskiej i Farmakopei Amerykańskiej.

W Laboratorium Analiz Biologicznych Jagiellońskiego Centrum Innowacji wykorzystujemy precyzyjną metodę kinetyczno-chromogenną, dzięki której jesteśmy w stanie szybko i dokładnie wykrywać nawet najniższe poziomy endotoksyn (do 0,005 EU/ml), z wynikiem już w 20 minut.

Bibliografia

  1. Miyamoto T, Okano S, Kasai N. Inactivation of Escherichia coli endotoxin by soft hydrothermal processing. Appl Environ Microbiol. 2009;75:5058–5063
  2. Lodowska J., Zięba A., Wolny D. i wsp.: Metody derywatyzacji komponentów lipopolisacharydów w ocenie ich struktury chemicznej technikami chromatograficznymi. Post Hig Med Dośw 2006; 60: 113–128
  3. Opal SM. Endotoxins and other sepsis triggers. Contrib Nephrol. 2010;167:14–24
  4. Chmielarz, M.; Sobieszczanska, B.; Środa-Pomianek K. Metabolic Endotoxemia: From the Gut to Neurodegeneration. Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 7006
  5. Cani, P. D., et al. (2007). Metabolic endotoxemia initiates obesity and insulin resistance. Diabetes, 56(7), 1761–1772.
  6. Erridge, C., et al. (2007). A high-fat meal induces low-grade endotoxemia. American Journal of Clinical Nutrition, 86(5), 1286–1292.
  7. Mohammad S and Thiemermann C (2021) Role of Metabolic Endotoxemia in Systemic Inflammation and Potential Interventions. Front. Immunol. 11:594150
  8. Michalak A., Pawlas K.: Endotoksyny jako źródło środowiskowego oraz zawodowego zagrożenia dla zdrowia człowieka. Med Środ/Environ Med 2013;16/2: 7-13
  9. Rylander R. Endotoxin in the environment–exposure and effects. J Endotoxin Res 2002;8:241–52
  10. Schneier M, Razdan S, Miller AM, Briceno ME, Barua S. Current technologies to endotoxin detection and removal for biopharmaceutical purification. Biotechnology and Bioengineering. 2020;1–22
  11. Munford, R. S. (2005). Endotoxemia—menace, marker, or mistake? Journal of Leukocyte Biology, 77(4), 476–483.
  12. Council of Europe. European Pharmacopoeia: supplement 11.6.; 5.1.10. Guidelines for using the test for bacterial endotoxins
  13. Council of Europe. European Pharmacopoeia: supplement 11.6.; 2.6.14. Bacterial Endotoxins.
  14. Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. June 2012.: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/guidance-industry-pyrogen-and-endotoxins-testing-questions-and-answers

Po więcej informacji odwiedź profil Jagiellońskiego Centrum Innowacji na Platformie Współpracy LSOS.

Materiały do powyższego artykułu zostały dostarczone przez Jagiellońskie Centrum Innowacji.

Poprzedni artykułInnowacyjny Szpital – nowe kierunki dla zrównoważonej opieki zdrowotnej. Dołącz do EIT Health Morning Health Talks